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    基因操作工具制備

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    AAV

    腺相關病毒( adeno-associated virus,AAV) 是一類細小病毒,基因組為單鏈DNA,對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。通常需要腺病毒或皰疹病毒幫助其在體內復制擴增。重組腺相關病毒(recombinant AAV, rAAV)是利用AAV2 型基因組與不同血清型的衣殼蛋白基因組結合產生的混合體病毒載體,可將目的基因的CDS 區序列或者RNAi 干擾序列插入rAAV 表達質粒中,包裝病毒后感染細胞完成對目的基因的操作。在人類和小鼠中,AAV 感染可以介導外源基因發生低頻率(不高于2%)的定向整合,插入的位置一般在19 號染色體短臂(人類基因組中的AAV S1 和鼠中的ROSA26 位點)。病毒基因組在不發生整合的情況下在被感染細胞內形成伴隨體。腺相關病毒廣泛應用在神經領域、心血管領域、肝臟、肌肉、、及其他領域,其主要的應用方向在于定位注射和整體注射。

    優勢

    AAV相比于其他病毒載體的優勢:

    a. 表達時間長: 絕大多數重組rAAV 不會整合到基因組上,而是在宿主細胞中串聯形成附加體(episome)存在于細胞核中 ,細胞在細胞復制和分裂后會丟失附加體,并因此失去基因表達能力,rAAV在細胞分裂不旺盛的組織中可持續表達6個月以上;
    b. 擴散性強: rAAV 的體積小,滴度高,因此具有遠高于腺病毒和慢病毒的擴散性,可以穿透血腦屏障,是理想的神經元和膠質細胞感染工具;
    c. 特異性強: rAAV 有十數種常用的血清型,不同的血清型對不同的臟器有較高的識別及感染能力,是動物實驗首選;
    d. 安全性高: 目前還沒有發現AAV 對人體致病,是美國FDA 批準的可以直接用于人體基因治療的最安全的病毒載體;
    e. 免疫原性低: 當AAV 用局部大劑量感染肌肉、腦、眼等組織時,不易造成免疫反應;
    f.  高穩定性: rAAV 病毒在4℃可以保存1 周,并且對氯仿等試劑具有抗性。

    病毒表達系統 腺相關病毒
    (Adeno-Associate virus)
    慢病毒
    (Lentivirus)
    腺病毒
    (Adenovirus)
    病毒基因組 單鏈DNA病毒 RNA病毒 雙鏈DNA病毒
    復制 條件復制 不可復制 條件復制
    滴度 最高可達1012-13v.g/ml 最高可達109TU/ml 最高可達1012pfu/ml
    感染細胞類型 感染分裂不旺盛的細胞 感染分裂和不分裂細胞 感染分裂和不分裂細胞
    表達豐度 高水平表達 中到高水平表達 高水平表達
    表達時間 1-2周 慢(2-4天) 快(1-2天)
    持續表達時間 病毒基因組游離于宿主基因組外,
    在分裂旺盛的細胞中可長時間表達
    病毒基因組整臺于宿主基因組,
    長時間、穩定表達外源基因
    病毒基因組游離于宿主基因組外,
    瞬時表達外源基因
    克隆容量 適合表達小于2.8kb的外源片段 適合表達小于4kb的外源片段 適合表達小于5kb的外源片段
    免疫原性 低免疫原性 低免疫原性 較高免疫原性
    安全性 暫無發現致病性,
    已通過歐盟和FDA許可,
    用作基因治療藥物的載體
    暫無發現致病性,
    已被用于CAR-T治療作用于人體
    可能會引起一些咳嗽流涕

    血清型選擇

    根據衣殼蛋白的差異,目前AAV可分為12種血清型(AAV-1~AAV-12)和100多種變異體。不同的AAV 具有不同的衣殼蛋白空間結構、序列和組織特異性,因而其識別與結合的細胞表面受體也相應有很大差別,這也導致不同血清型轉染的細胞類型和感染效率也各不相同,那么如何選擇合適的血清型呢,首先我們需要了解下AAV 不同血清型的組織趨向性。

    血清型 簡介
    1 順行示蹤跨單突觸。適合神經等方向的研究
    2 胞外吸附分子為硫酸乙酰肝素蛋白多糖,適合于神經等方向的研究
    5 胞外吸附分子為N-唾液酸,適合肺、眼睛、神經等
    6 適合血液細胞,比如T細胞
    8 適合肝臟,受體為LamR
    9 最廣譜的血清型,感染全身效果極好,可以穿過血腦屏障、眙盤屏障
    DJ 適合體外實驗、細胞
    DJ/8 適合肝臟,眼,中樞神經,肌肉
    PHP.eB 基于PHP.B,加強版,更適合中樞神經系統
    PHP.B 在神經元和神經膠質中感染效率超高,大約是9型的40倍。
    PHP.S 能夠感染外周神經元
    Retro 逆向標記血清型


    吉凱為您總結不同部位適合的血清型,供您參考。


    1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
    心臟






    肝臟












    胰腺






    骨骼肌




    神經

    眼部







    吉凱小建議:
    1. 如您不確定選擇哪種血清型,可嘗試使用感染譜最廣的9型。
    2. 如初次使用AAV,可使用AAV彩虹裝進行預實驗,通過彩虹裝比較不同血清型對目標組織的感染效果,摸索最佳的注射方法、注射位點、病毒用量等,以便得到更理想的實驗結果。


    AAV彩虹裝
    AAV彩虹裝是吉凱基因通過查詢相關文獻,將適合不同組織的常用血清型組合而成的套裝產品。點擊購買AAV彩虹裝>>

    彩虹裝 血清型 提供量
    眼/其他器官 1/2/5/6/8/9/DJ 10μL/種血清型
    神經系統 1/9/Retro/PHP. eB 10μL/種血清型
    肝臟/腎臟 2/8/9/DJ 100μL/種血清型
    心臟/血管/肌肉 1/6/8/9 100μL/種血清型

    *各血清型在神經系統研究中作用:1型,可作為順行示蹤跨單突觸標記的血清型使用 ;9型,可作為順行示蹤非跨突觸標記的血清型使用;Retro,可作為逆向示蹤非跨突觸標記的血清型使用; PHP.eB,適合中樞神經系統,可穿過血腦屏障、胎盤屏障,常通過尾靜脈注射使用 。

    載體選擇

    吉凱提供多種AAV載體,可通過過表達、RNAi等技術操作編碼基因和非編碼基因,如lncRNA、microRNA、circRNA。點擊查看載體圖譜>>


    調控方式 載體編號 元件順序 載體容量(bp) 熒光 熒光是否
    融合表達
    過表達 GV388 CMV bGlobin-MCS-EGFP-3FLAG-WPRE -hGH polyA 1207

    EGFP

    融合
    GV389 CMV bGlobin-MCS-mCherry-3FLAG-WPRE-hGH polyA 1207 mCherry 融合
    GV410 CMV bGlobin-MCS-3FLAG-T2A-EGFP 1130 EGFP 非融合
    GV411 CMV-betaGlobin-MCS-3Flag-SV40 PolyA 2819

    GV461 CMV-betaGlobin-MCS-SV40 PolyA 2890

    GV467 CMV- betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA 2095 EGFP 融合
    GV489 CMV bGlobin-EGFP-MCS-WPRE-hGH polyA 1285 EGFP 融合
    GV466 hSyn promoter-MCS-EGFP-3FLAG-SV40 PolyA 2186 EGFP 融合
    GV475 hSyn promoter-MCS-mcherry-3FLAG-SV40 PolyA 2186 mCherry 融合
    GV488 gfaABC1D promoter-MCS-EGFP-WPRE-bGH PolyA 1591 EGFP 融合
    干擾 GV478 U6-MCS-CAG-EGFP
    EGFP 非融合
    GV480 U6-MCS-CAG-mCherry
    mCherry 非融合
    miRNA-up GV412 CMV bGlobin-EGFP-MCS-WPRE-hGH polyA
    EGFP 非融合
    GV413 CMV bGlobin-mCherry-MCS -WPRE-hGH polyA
    mCherry 非融合
    miRNA-down GV479 U6-MCS-CAG-EGFP
    EGFP 非融合
    GV480 U6-MCS-CAG-mCherry
    mCherry 非融合

    特色產品

    1.  現貨AAV產品
    光遺傳、化學遺傳、鈣指示劑是神經研究常用的技術。登錄吉凱商城查詢與購買:光遺傳、化學遺傳、鈣指示劑等現貨AAV產品,此外,還有熒光示蹤、重組酶、AAV彩虹裝等現貨AAV產品,共108種類,滿足您不同的實驗需求。

    現貨AAV產品涵蓋2/5/8/9 四種血清型。最快5 個工作日發貨。


    2.  組織特異性啟動子AAV

    吉凱提供20余種組織特異性啟動子AAV載體(下圖),可快速實現動物水平組織特異性調控,更高效更精準地表達外源基因。

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    應用實例

    1. AAV 在神經系統中的應用

    代表文獻 吉凱客戶文章Molecular Psychiatry,(2017)00,1-13

    文獻來源:Gene deficiency and pharmacological inhibition of caspase-1 confers resilience to chronic social defeat stress via regulating the stability of surface AMPARs.


    代表文獻 吉凱客戶文章Neuropharmacology, 128(2018) 207-220.

    文獻來源:Inhibition of Cdk5 rejuvenates inhibitory circuits and restores experience-dependent plasticity in adult visual cortex.




    2. AAV在眼科中的應用

    代表文獻 Science,2010,329(5990):413

    文獻來源:Genetic reactivation of cone photoreceptors restores visual responses in retinitis pigmentosa.




    3. AAV 在肝臟中的應用

    代表文獻 吉凱客戶文章Cellular physiology and biochemistry,2016,40(5):1117

    文獻來源:Mesenchymal stem cells with enhanced Bcl-2 expression promote liver recovery in a rat model of hepatic cirrhosis.




    4. AAV 在脂肪中的應用
    代表文獻 吉凱客戶文章Jci Insight,2017,2(4):e89044

    文獻來源:Switching harmful visceral fat to beneficial energy combustion improves metabolic dysfunctions.


    更多部位體內注射參數,點擊查看與下載>>
    更多體內注射實驗操作視頻,點擊查看與下載>>

    引用文獻

    1. Gephyrin Palmitoylation in Basolateral Amygdala Mediates the Anxiolytic Action of Benzodiazepine. Biological Psychiatry (IF=11.982). 吉凱產品:過表達AAV 研究領域:焦慮癥  華中科技大學同濟醫學院
    2. Gene deficiency and pharmacological inhibition of caspase-1 confers resilience to chronic social defeat stress via regulating the stability of surface AMPARs. Molecular Psychiatry (IF=11.64). 吉凱產品:過表達AAV  血清型AAV1 研究領域:抑郁癥  華中科技大學同濟醫學院
    3. Hippocampal PPARα is a novel therapeutic target for depression and mediates the antidepressant actions of fluoxetine in mice. British journal of pharmacology (IF=6.81). 吉凱產品:干擾AAV 研究領域:抑郁癥  南通大學藥學院
    4. Overexpression of LH3 reduces the incidence of hypertensive intracerebral hemorrhage in mice. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM (IF=6.045). 吉凱產品:干擾AAV 血清型AAV9 研究領域:高血壓性腦出血  中國醫學科學院阜外醫院
    5. Long non-coding RNA H19 contributes to apoptosis of hippocampal neurons by inhibiting let-7b in a rat model of temporal lobe epilepsy. Cell Death and Disease (IF=5.638). 吉凱產品:干擾和過表達AAV 血清型AAV9 研究領域:顳葉癲癇  首都醫科大學
    6. Mesenchymal Stem Cells with Enhanced Bcl-2 Expression Promote Liver Recovery in a Rat Model of Hepatic Cirrhosis. Cellular Physiology and Biochemistry (IF=5.5). 吉凱產品:過表達AAV 研究領域:肝硬化  哈爾濱醫科大學附屬第二醫院
    7. LncRNA H19 contributes to hippocampal glial cell activation via JAK/STAT signaling in a rat model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroinflammation (IF=5.193). 吉凱產品:干擾和過表達AAV 血清型AAV9 研究領域:顳葉癲癇  首都醫科大學

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