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    基因操作工具制備

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    非編碼基因文庫

    非編碼RNANon-coding RNA)是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子。常見的具有調控作用的非編碼RNA包括siRNA、miRNA、piRNA、circRNA以及長鏈非編碼RNAlncRNA)。越來越多的實驗數據證明它們在基因沉默、細胞分化、蛋白合成與功能調節、代謝調控、器官發育等眾多生物學過程中起調控作用。

    LncRNA

    lncRNA是長度大于200bp的RNA,具有保守的二級結構,可與蛋白、DNA和RNA相互作用,參與調控多種生物學過程,如腫瘤發生、表觀遺傳、轉錄及轉錄后調控等。起初lncRNA被認為是基因組轉錄的“噪音”,是RNA聚合酶II轉錄的副產物,不具有生物學功能 。然而,1991年,Nature等雜志刊文(Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome)報道了Xist參與X染色體失活的調控,此后越來越多研究表明,lncRNA在眾多生命活動過程中發揮重要作用,同時二代測序技術的發展,使得lncRNA備受關注,成為研究熱點。

    LncRNA產品與載體

    LncRNA 產品介紹

    吉凱基因提供質粒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒等四種基因操作工具,為您提供全面的lncRNA 解決方案。

    操作工具 產品名稱 簡介 產品規格
    質粒 過表達質粒 用于過表達IncRNA 10ug (含等量對照)
    RNAi-定制-shRNA質粒 用于下調IncRNA,需提供靶點序列 10ug (含等量對照)
    慢病毒 過表達慢病毒 用于過表達IncRNA 1E+8TU (含等量對照)
    RNAi-定制-慢病毒 用于下調IncRNA,需提供靶點序列 1E+8TU (含等量對照)
    Cas9-KO-定制-慢病毒 用于敲除IncRNA,需提供靶點序列 1E+8TU (含等量對照)
    腺病毒 過表達腺病毒 用于過表達IncRNA 2E+10PFU (含等量對照)
    RNAi-定制-腺病毒 用于下調IncRNA,需提供靶點序列 2E+10PFU (含等量對照)
    腺相關病毒 過表達腺相關病毒 用于過表達IncRNA 1E+12v.g (含等量對照)
    RNAi-定制-腺相關病毒 用于下調IncRNA,需提供靶點序列 1E+12v.g (含等量對照)




    LncRNA 載體選擇

    吉凱基因為您提供用于LncRNA 研究的多種載體。點擊查看載體圖譜>>

    類別 調控方式 載體編號 元件順序 載體大小/bp 原核抗性 真核抗性
    質粒 過表達 GV219 CMV-MCS- SV40-Neomycin 5427 Ampicillin Neomycin
    干擾 GV102 hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin 6380 Ampicillin Neomycin
    慢病毒 過表達 GV502 (polyA-MCS-UBI)RV- SV40-EGFP-IRES-puromycin 11662 Ampicillin IRES-Puromycin
    干擾 GV112 hU6-MCS-CMV-Puromycin 7402 Ampicillin Puromycin
    GV115 hU6-MCS-CMV-EGFP 7522 Ampicillin
    Cas9-KO GV504 U6-multiple(sgRNA)-SV40-EGFP 9492 Kanamycin
    腺病毒 過表達 GV315 CMV-MCS-SV40-EGFP 5180 Ampicillin
    干擾 GV119 hU6-MCS-CMV-EGFP 5131 Ampicillin
    腺相關病毒AAV 過表達 GV551 CMV bGlobin-EGFP-MCS-hGH polyA 5397 Ampicillin
    GV461 CMV-betaGlobin-MCS - SV40 PolyA 5202 Ampicillin
    干擾 GV478 U6-MCS-CAG-EGFP 6888 Ampicillin
    GV480 U6-MCS-CAG-mCherry 6879 Ampicillin

    miRNA

    miRNA,又稱microRNA,是指一類由內源基因編碼的長度約為22nt 的非編碼單鏈RNA分子,由細胞內源產生的發卡結構轉錄本加工而來。miRNA通過其種子序列(5‘ 端第2-8位核苷酸)識別靶基因mRNA 3’UTR上的結合位點,攜帶RISCRNA誘導沉默復合體,RNA-induced silencing complex,RISC)發揮對靶基因的抑制作用。




    miRNA的調控方式

    1.  miRNA-up

    miRNA的過表達載體中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三種形式。其中pri-miRNA(含側翼序列)的方式由于保留了每個microRNA獨自的原始天然雙臂結構,效果更好,是應用最為廣泛的方法。

    2. miRNA-down

    miRNA-down載體轉錄后表達的miRNA抑制劑(miArrest)可高效、特異地結合細胞內成熟的靶miRNA,形成穩定的復合物,阻止了miRNA對靶標mRNA的降解或者翻譯抑制,上調miRNA靶標基因的表達。獨特的載體設計確保最大程度抑制強度、抑制持久性和特異性,同時將脫靶效應降至最低。




    如何進行miRNA靶基因預測及驗證


    1. miRNA靶基因預測

    miRNA通過靶向調控基因(如編碼基因、lncRNA等)發揮調控作用。miRNA和靶基因的作用模式相對簡單,許多權威的數據庫就可以進行miRNA與靶基因的結合位點預測。


    1.1  miRNA與編碼基因的結合位點預測:如targetscan,miranda,miRDB等數據庫就可以進行miRNA與編碼基因的結合位點預測。

    1.2  miRNA與lncRNA的結合位點預測:如starbase、mircode、BiBiServ2-RNAhybrid等數據庫。starbase可以直接預測miRNA與lncRNA的結合位點,只需要選擇對應的microRNA和對應的lncRNA即可。mircode在對應的位置輸入基因名稱和miRNA家族即可進行預測。BiBiServ2-RNAhybrid網站可以通過提交一段序列和一個或者多個miRNA進行結合位點預測。


    2. miRNA靶基因驗證

    通過使用免費數據庫預測出感興趣的miRNA可能與哪些靶基因結合,隨后就是用實驗方法驗證預測結果了,可以使用熒光素酶報告基因檢測方法或者也可直接檢測miRNA過表達或下調表達后,靶基因在mRNA(qRT-PCR方法)或蛋白水平上的變化(Western Blot方法)。下面以熒光素酶報告基因檢測方法為例做簡要說明:


    2.1  如何判斷實驗體系無異常,獲得客觀的實驗結果?可以從以下幾個方面來考察實驗結果的客觀性:

    · 對照的2個實驗組,即實驗組1與實驗組2 luc表達情況應無顯著差異;

    · 轉染正常,質?;騧imic確保成功轉染入細胞;

    · luc檢測值在儀器檢測線性范圍內。


    2.2  轉染成功如何判斷?

    共轉染的幾個質粒中,3' UTR質粒及Renilla質??赏ㄟ^最終的luc讀值判斷是否轉染成功,而miRNA質?;騧imic的轉染情況無法從最終的luc讀值做出判斷,因而針對miRNA,轉染是否成功可用以下方法進行:

    · 如轉入的miRNA帶熒光標記如GFP,則可直接在轉染后、細胞裂解前,顯微鏡下觀察細胞熒光;

    · 如轉入的miRNA不帶任何熒光標記,可考慮進行miRNA的qRT-PCR檢測,通過檢測結果判斷實驗組2、4、6是否相對其對照組miRNA有顯著過表達。

    · 設置一個熒光質粒轉染參照組,同批轉染一個組的細胞,間接反映出同批次實驗的轉染情況。


    2.3  陰性結果如何理解?

    在確保實驗體系無異常的前提下,如最終檢測到的結果是陰性結果,則基本可以判斷目的miRNA不能直接調控靶基因的表達。如陽性結果和陰性結果都出現過,需進行重復驗證,結果一直波動的話可能是實驗系統或其他原因。


    2.4  實驗體系是否可以優化?如何優化?

    實驗關鍵點在細胞狀態和轉染效率,轉染效率的優化可通過調整共轉染質粒的比例或調整轉染體系來進行,設置合理的質粒轉染量梯度,觀察microRNA對靶基因的抑制是否存在劑量效應或是否存在變化趨勢的一致性,從而使結論更加可靠。

    miRNA產品與載體

    miRNA產品介紹

    吉凱基因提供質粒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒等四種基因操作工具,為您提供全面的miRNA 解決方案。

    產品類別 產品名稱 簡介 產品規格
    質粒 microRNA-up 用于過表達miRNA 10ug (含等量對照)
    microRNA-down 用于下調miRNA 10ug (含等量對照)
    慢病毒 microRNA-up 用于過表達miRNA 1E+8TU (含等量對照)
    microRNA-down 用于下調miRNA 1E+8TU (含等量對照)
    腺病毒 microRNA-up 用于過表達miRNA 2E+10PFU (含等量對照)
    microRNA-down 用于下調miRNA 2E+10PFU (含等量對照)
    腺相關病毒 microRNA-up 用于過表達miRNA 1E+12v.g (含等量對照)
    microRNA-down 用于下調miRNA 1E+12v.g (含等量對照)




    miRNA載體選擇

    吉凱基因為您提供用于miRNA 研究的多種載體。點擊查看載體圖譜>>

    類別 調控方式 載體編號 元件順序 原核抗性 真核抗性
    質粒 microRNA-down GV249 hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin Ampicillin Neomycin
    microRNA-up GV268 CMV-MCS-SV40-Neomycin Ampicillin Neomycin
    GV251 hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin Ampicillin Neomycin
    慢病毒 miRNA-up GV369 Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES- puromycin Ampicillin Puromycin
    GV209 H1-MCS-CMV-EGFP Ampicillin
    GV309 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES - puromycin Ampicillin Puromycin
    miRNA-down GV280 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES- puromycin Ampicillin Puromycin
    GV234 hU6-MCS-CMV-EGFP Ampicillin
    腺病毒 miRNA-up GV202 hU6-MCS-CMV-EGFP Ampicillin
    GV317 CMV-MCS-SV40-EGFP Ampicillin
    miRNA-down GV201 hU6-MCS-CMV-EGFP Ampicillin
    腺相關病毒 miRNA-up GV412 CMV bGlobin-EGFP-MCS-WPRE-hGH polyA Ampicillin
    GV413 CMV bGlobin-mCherry-MCS-WPRE-hGH polyA Ampicillin
    miRNA-down GV479 U6-MCS-CAG-EGFP Ampicillin
    GV480 U6-MCS-CAG-mCherry Ampicillin

    circRNA

    有別于LncRNA、mRNA、miRNA 等這些線性的RNA,circRNA 以其閉環特征成功贏得了廣大科研工作者的青睞,成為近來研究的熱點。circRNA 由特殊的可變剪切產生,廣泛存在于真核細胞內且表達有一定的組織、時序和疾病特異性。circRNA 研究較多的功能有兩點:一是充當ceRNA 作為miRNA“海綿,解除miRNA 對編碼基因的翻譯抑制;二是結合轉錄相關復合物調控親本基因表達。但如何實現circRNA “gain of function”“loss of function”調控,對很多人來說是難點。




    circRNA 的研究方法

    1. circRNA序列的獲得

    網站:http://www.circbase.org/,輸入circRNA名稱搜索(以hsa_circ_0032627為例),打開fasta(下圖)


    hsa_circ_0032627搜索結果


    “circRNA sequence”選擇“spliced”,下方選“search”即可得到成環序列;選擇“genomic”,下方選擇“Extend upstream by 1000 bases”即可得到上游延伸1000bp的包含成環以及內含子的序列(下圖)。

    序列查找界面

    2. circRNA過表達構建

    目前文獻多采用內源性的成環序列上游臂1kb,并生成這1kb的反向互補序列作為下游臂,將這兩個臂構建至成環序列上下游并在成環序列兩端加上AG-GT剪切序列。這種包含ALU序列及穩定二級結構的構建方式成環效率最高(下圖)。

    circRNA過表達載體構建方法

    3. circRNA干擾靶點設計

    由于很多環狀RNA屬于外顯子成環,所以,如果針對成環序列設計,靶點同時會脫靶至本底基因。由此,靶點只能設計在成環接頭處,一般一個環狀RNA只能設計1-2條靶點。直接在接頭處的40-45bp設計靶點即可(下圖)。

    circRNA產品與載體

    circRNA產品介紹

    吉凱基因提供質粒、慢病毒、腺病毒等基因操作工具,為您提供全面的circRNA 解決方案。

    操作工具

    產品名稱

    簡介

    產品規格

    周期(工作日)

    質粒

    過表達質粒

    用于過表達circRNA

    10ug(含等量對照)

    16

    RNAi-定制-shRNA質粒

    用于下調circRNA,需提供靶點序列

    10ug(含等量對照)

    15

    慢病毒

    過表達慢病毒

    用于過表達circRNA

    1E+8TU(含等量對照)

    20

    RNAi-定制-慢病毒

    用于下調circRNA,需提供靶點序列

    1E+8TU(含等量對照)

    20

    腺病毒

    過表達腺病毒

    用于過表達circRNA

    2E+10PFU(含等量對照)

    45

    RNAi-定制-腺病毒

    用于下調circRNA,需提供靶點序列

    2E+10PFU(含等量對照)

    45




    circRNA載體選擇

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    病毒載體 調控方式 載體編號 元件順序 原核抗性 真核抗性
    質粒 過表達 GV486 CMV-left circular frame-MCS-right circular frame-EF1a-copGFP-SV40-Neomycin Kanamycin Neomycin
    GV485 CMV-left circular frame-MCS-right circular frame-SV40-neomycin Ampicillin Neomycin
    干擾 GV102 hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin Ampicillin Neomycin
    慢病毒 過表達 GV502 (polyA-MCS-UBI)RV-SV40-EGFP-IRES-puromycin Ampicillin IRES-Puromycin
    干擾 GV493 hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin Ampicillin IRES-Puromycin
    GV112 hU6-MCS-CMV-Puromycin Ampicillin puromycin
    GV248 hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin Ampicillin puromycin
    GV118 U6-MCS-Ubi-EGFP Ampicillin
    GV115 hU6-MCS-CMV-EGFP Ampicillin
    腺病毒 過表達 GV535 UBI-left circular frame-MCS-right circular frame-SV40-EGFP Ampicillin
    GV530 CMV-left circular frame-MCS-right circular frame-SV40-EGFP Ampicillin
    干擾 GV119 hU6-MCS-CMV-EGFP Ampicillin

    注:GV502慢病毒過表達載體應用于circRNA時需經售前優化。

    引用文獻

    1. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. 2018, nature communications (IF=12.353). 吉凱產品:microRNA-down慢病毒  研究領域:肝癌  第二軍醫大學附屬東方肝膽外科醫院

    2. MicroRNA 301A Promotes Intestinal Inflammation and Colitis-Associated Cancer Development by Inhibiting BTG1. 2017, Gastroenterology (IF=20.773). 吉凱產品:miRNA慢病毒  研究領域:腸道炎癥和結腸炎  上海市第十人民醫院

    3. miR-3188 regulates nasopharyngeal carcinoma proliferation and chemosensitivity through a FOXO1-modulated positive feedback loop with mTOR–p-PI3K/AKT-c-JUN. 2016, Nature Communications (IF=12.353). 吉凱產品:RNAi慢病毒和miRNA慢病毒  研究領域:鼻咽癌  南方醫科大學

    4. The long intergenic noncoding RNA UFC1, a target of microRNA 34a, interacts with the mRNA stabilizing protein HuR to increase levels of β-catenin in HCC cells. 2015, Gastroenterology (IF=20.773). 吉凱產品:lncRNA干擾慢病毒  研究領域:肝癌  南方醫科大學南方醫院

    5. miR-301a promotes intestinal mucosal inflammation through induction of IL-17A and TNF-α in IBD. 2015, Gut (IF=17.016). 吉凱產品:micro-up,micro-down慢病毒  研究領域:腸粘膜炎癥  上海第十人民醫院

    6. Repression of the Long Noncoding RNA-LET by Histone Deacetylase 3 Contributes to Hypoxia-Mediated Metastasis. 2013, Molecular Cell (IF=14.248). 吉凱產品:lncRNA過表達,干擾慢病毒  研究領域:lncRNA機制研究  第二軍醫大學東方肝膽醫院

    7. Silencing circular RNA hsa_circ_0000977 suppresses pancreatic ductal adenocarcinoma progression by stimulating miR-874-3p and inhibiting PLK1 expression. 2018, Cancer Letters (IF= 6.491). 吉凱產品:circRNA干擾慢病毒  研究領域:胰腺癌  南方醫科大學珠江醫院

    8. Long non-coding RNA H19 contributes to apoptosis of hippocampal neurons by inhibiting let-7b in a rat model of temporal lobe epilepsy. 2018, Cell Death and Disease (IF=5.638). 吉凱產品:干擾和過表達LncRNA H19 AAV  血清型:AAV9  研究領域:顳葉癲癇  首都醫科大學

    9. LncRNA H19 contributes to hippocampal glial cell activation via JAK/STAT signaling in a rat model of temporal lobe epilepsy. 2018, Journal of Neuroinflammation (IF=5.193). 吉凱產品:干擾和過表達LncRNA H19 AAV  血清型:AAV9  研究領域:顳葉癲癇  首都醫科大學

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