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    基因操作工具制備

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    心血管

    心血管疾病是當今威脅人類最嚴重的疾病之一。使用工具病毒對心血管疾病特定基因進行定向和組織特異性的改造,將為心血管研究提供強大工具。

    常用模型

    心血管領域常用模型

    常在提取的原代心肌細胞或者血管平滑肌細胞上,構建心血管疾病細胞模型,例如缺血缺氧模型。一些更高級別的文章,則會在細胞模型的基礎上,進一步利用動物實驗進行更嚴謹的在體水平驗證。下面是心血管系統常見的一些細胞模型。

    病毒表達系統 造模方法 參考文獻
    心肌缺血缺氧模型 用異丙腎上腺素,或用低氧氣體誘導 [1]
    心肌缺血再灌注模型 用缺氧培養基替換正常實現缺氧再用復氧培養基復氧 [2]
    心肌氧化性損傷模型 20μmol/LH2O2作用心肌細胞90min后分別收集細胞 [3]


    參考文獻

    1. X Yan, J Tian, H Wu, et al. Ginsenoside rb1 protects neonatal rat cardiomyocytes from hypoxia/ischemia induced apoptosis and inhibits activation of the mitochondrial apoptotic pathway. Evidence-Based Complementray and Alternative, 2014, 2014(2): 149195.

    2. Y Fujio, T Nguyen, D Wencker, et al. Akt promotes survival of cardiomyocytes in vitro and protects against ischemia-reperfusion injury in mouse heart. Circulation, 2000, 101 (6): 660-667.

    3. X Long, MJ Goldenthal, GM Wu, et al. Mitochondrial Ca2+flux and respiratory enzyme activity decline are early events in cardiomyocyte response to H2O2. Journal of Molecular & Cellular Cardiology, 2004, 37(1): 63-70.

    工具病毒選擇指南

    心血管系統研究如何挑選合適的工具病毒

    慢病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)等都是常用的工具病毒載體,在心血管系統的研究中該如何選擇呢?

    1.  慢病毒:慢病毒的優點是可以將靶基因整合入宿主的基因組中持續穩定的表達,引起的免疫反應較為溫和。但是其缺點是在體注射時,對心血管系統的細胞(特別是心肌細胞)缺乏特異性的趨向性,實驗者往往需要通過心肌注射的方法來實現心肌細胞的轉染,而開胸實驗的難度較大,易導致動物死亡,因此影響其廣泛應用。

    2.  腺病毒:許多心血管疾病的研究會使用腺病毒載體進行,因為腺病毒對心肌細胞的感染效果較好,并且靶基因的表達效果較好。但其表達是瞬時的(一般在心肌細胞中可持續1-4周),且易引起較強烈的免疫反應,嚴重時可導致實驗動物死亡。

    3.  腺相關病毒AAV:與腺病毒相比,AAV對心肌細胞具有更高的感染效率。運用AAV載體的另一個顯著優點是有些AAV血清型,如AAV1、AAV6、AAV8和AAV9等對于心肌細胞具有較高的趨向性,可直接靜脈注射感染,不需要復雜危險的開胸手術,因此現有的Ⅱ期臨床試驗,均使用AAV。點擊了解更多AAV血清型選擇小竅門>>


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    心臟






    肝臟












    胰腺






    骨骼肌




    神經

    眼部




    AAV 血清型的趨向性




    了解了這些病毒載體在心血管系統應用中的優勢和不足后,如何根據具體的實驗需求和基因情況選擇合適的病毒載體呢?我們需要考慮這幾個方面:

    1.  工具載體的表達時間與實驗觀察時間是否相符;

    2.  工具載體可以容納的片段大小與目的基因大小是否契合;

    3.  工具載體對目的細胞、在體組織的轉導是否足夠高效。


    下表總結了常用基因操作工具的選擇方法:

    病毒表達系統 慢病毒 腺病毒 腺相關病毒
    外源基因表達時間 2-4天開始表達長時間穩定表達 1-2天開始表達持續7-14天 7-14開始表達
    細胞分裂不旺盛部位可長時間表達
    插入片段大小 <4kb <5-8kb <2.8kb (包括必須的啟動子
    以及熒光或者標簽元件)
    穩定細胞株篩選 可以,外源基因整合于
    宿主基因組,篩選簡單
    不可以,瞬時表達外
    源基因傳代后效果減弱
    不可以
    細胞實驗 首選,廣譜,感染效率高 廣譜,感染效率高,
    適合原代非增殖細胞感染
    不適合細胞實驗
    動物實驗 適合,根據觀察時間和注射部位選擇 較適合(免疫原性高),根
    據觀察時間和注射部位選擇
    首選,根據觀察時間和注射部位選擇
    滴度 最高可達109TU/ml 高達1012pfu/ml 高達1012-13v.g/ml




    吉凱小建議:

    1.  在體實驗建議選擇腺相關病毒,它具有滴度高,擴散效果好,免疫原性低等特點。且AAV 1/6/8/9等血清型對心臟均具有較好的親和性,可直接尾靜脈注射感染心臟,不需要復雜危險的開胸手術。

    2.  心肌細胞體外感染建議選擇慢病毒或腺病毒:慢病毒在感染原代心肌細胞后2-4 天開始表達,且對心肌細胞的毒性低、損傷??;腺病毒在感染原代心肌細胞后1-2天開始表達,感染效率高,表達快。

    3.  如需目的基因在心肌或平滑肌細胞中特異性表達,可使用特異性啟動子,如心肌細胞特異性啟動子cTnT、心肌細胞早期特異性啟動子mNkx2.5及平滑肌細胞特異性啟動子SM22a。吉凱提供組織特異性啟動子載體的病毒包裝服務,點擊了解>>

    注射方法

    心血管系統病毒注射方法

    工具病毒在心血管系統的注射方法總體上包括靜脈注射、心腔內注射、心肌內定點注射、心包內注射(介于心肌與心包膜之間),其中靜脈注射包括尾靜脈注射、頸靜脈注射、面部靜脈注射等。其中最常用的是心肌定點注射和尾靜脈注射病毒的方法。


    1. 頸靜脈注射、心腔內注射、心肌內定(多)點注射、心包內注射

    心腔內注射需要結合主動脈嵌夾進行,由于開胸腔手術需要輔助呼吸,對手術操作要求較高。注射體積約為20μL 左右。心肌內定點注射時,使用 27-29G 的針頭,每點注射約 2-5μL,注意緩慢注射,病毒在注射的局部點附近感染較好,擴散有限。
    2. 尾靜脈注射感染
    由于心臟血流快等原因,尾靜脈注射的病毒不容易富集在心臟,因此相比其他器官,尾靜脈注射需要更大的病毒量。




    實驗操作方法
    下面以大鼠氣管切開插管,心肌定點注射病毒為例做詳細介紹:
    a. 固定大鼠仰臥于手術臺上。剪除頸部及胸部被毛。

    b. 縱形剪開頸部皮膚1.5~2cm,分離皮下組織及肌肉,并顯露其上甲狀腺腺體。

    c. 于腺體后方鈍性分離氣管并帶線,注意勿損傷腺體及血管,提起絲線,剪刀于氣管環之間剪開氣管半周。

    d. 行氣管插管,接呼吸機。調整呼吸頻率、吸呼比及潮氣量(常見潮氣量為2~3 ml /次,呼吸頻率為60次/min,呼吸比為1∶1.5,需要根據呼吸機使用指南及大鼠表現調節)。

    e. 胸骨左緣3 mm縱形剪開胸部皮膚約4 cm。鈍性分離皮下、胸大肌與前鋸肌。第三肋間逐步剪開肋間肌,顯露胸膜。

    f. 找準進入位點,一般是在心跳明顯處,用鑷子于呼氣時刺破胸膜,進入胸腔。撐開肋骨,撕破心包,顯露心臟。必要時可于左外側墊紗布隔開左肺。

    g. 在心肌表面,注射病毒,可以以心臟長軸距離心尖0.5 mm處為中心,在其上下左右2 mm處分四點于心肌內注射病毒,注射成功后可見局部顏色由紅色轉為白色,也可以根據想要標記的肌肉大小進行調整,一般都選擇多點注射病毒,病毒擴散效果比較好。病毒注射以后,探查無出血后關胸,注意勿縫到心肺及血管。在縫合過程中胸腔留置吸引管一根,其他部分的肌肉皮膚進行逐層縫合。

    h. 在縫合完畢以后,針筒抽吸胸腔積氣積液,并拔除吸引管。

    i. 大鼠蘇醒后,待其狀態良好,拔除氣管插管,停止人工呼吸,清除氣道血塊及分泌物,進行一針縫合氣管及肌肉切口,并將小鼠放回鼠籠常規喂養。




    注意事項

    a. 如果經口插管建立輔助呼吸,那么氣管插管次數不宜太多,因插管次數太多易致喉水腫而窒息死亡,插管時用小鑷子拉出鼠舌,順舌根插成功率較高,插管后接呼吸機,若小鼠胸廓起伏與呼吸機頻率一致,提示插管成功。

    b. 心肌定點注射病毒時,注意排空注射器內空氣,以免造成空氣栓塞導致小鼠死亡。

    c. 由于小鼠心肌比較薄,故注射液體時注射器針頭不能刺入太深以防注入心腔。


    更多工具病毒體內注射實驗操作視頻,點擊查看>>

    用量參考

    心血管系統病毒用量參考

    以下表格中為吉凱客戶應用文獻總結(部分)。更多心血管系統病毒注射參數,點擊查看與下載>>


    1. 慢病毒

    物種 注射部位 注射參數 檢測時間 文獻
    小鼠 左心室腔 100μl/小鼠
    病毒滴度2.5E+7 TU/ml
    注射總量2.5E+6 TU

    Simvastatin alleviates cardiac fibrosis induced by infarction via up- regulation of TGF- β receptor III expression[J]. British journal of pharmacology, 2015.
    大鼠 左心室前壁 200μl/小鼠
    病毒滴度4E+8pfu/ml
    注射總量8E+7pfu
    7天 Down-regulation of microRNA-320 suppresses cardio-myocyte apoptosis and protects against myocardial isch-emia and reperusion injury by targeting IGF- 1[J]. Oncotar-get, 2016.
    大鼠 左心室壁 100μl/小鼠
    注射總量-5E+7 TU

    Knockdown of farnesylpyrophosphate synthase prevents angiotensin l-mediated cardiac hypertrophy[J]. The inter-national journal of biochemistry & cell biology, 2010.
    大鼠 尾靜脈注射 300μl/小鼠
    注射總量2E+8 of
    HIV/小鼠一天內注射2次
    3天 Candesartan antagonizes pressure overload-evoked car-diac remodeling through Smad7 gene-dependent MMP-9 suppression[J]. Gene.


    代表文獻 Circulation,2016:CIRCULATIONAHA.116.017949.






    2. 腺病毒

    物種 注射部位 注射總量 檢測儀器 檢測時間 文獻
    大鼠 左心室 200μl/大鼠
    注射總量1E+9 pfu
    30號針頭
    MiR- 101 inhibited post-infarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via FOS/TGF β 1 pathway[J]. Circulation, 2012.
    小鼠 左心室 200μ/小鼠
    注射總量1E+9 pfu
    23號導管 2周 In vitro and in vivo direct monitoring of miRNA-22 expression in isoproterenol-induced cardiac hypertophy by bioluminescence imagig.U] .Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging.
    大鼠 左心室游離壁 6位點注射,200μ/大鼠
    注射總量3E+9 pfu/rat
    30號針頭 3周 α -Enolase plays a calyically independent role in doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis and mitochondrial dysfunction[J]. Journal of mo-lecular and cellular cardiology.


    代表文獻 吉凱客戶文章Cardiovascular research,2014:cvu007.





    3. 腺相關病毒

    注射物種 注射部位 AAV類型 注射參數 檢測時間 文獻
    大鼠 尾靜脈注射 過表達SIRT6 5E+10 4周 The sirtuin 6 prevents angiotensin l-mediated myocardial fibrosis and injury by targeting AMPK- ACE2 sigaling[J]. Oncotarget.



    代表文獻

    引用文獻

    1. Simvastatin alleviates cardiac fibrosis induced by infarction via up‐regulation of TGF‐β receptor III expression[J]. 2015, British journal of pharmacology (IF= 6.81). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:心臟纖維化  哈爾濱醫科大學
    2. Deletion of sirtuin 6 accelerates endothelial dysfunction and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. 2016, Translational Research (IF= 4.88). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:動脈粥樣硬化  中山大學
    3. The sirtuin 6 prevents angiotensin II-mediated myocardial fibrosis and injury by targeting AMPK-ACE2 signaling[J]. 2017, Oncotarget. 吉凱產品:腺相關病毒  研究領域:心肌纖維化  上海交通大學附屬瑞金醫院
    4. MiR-101 inhibited post-infarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via FOS/TGFβ1 pathway[J]. 2012,Circulation (IF= 18.881). 吉凱產品:腺病毒  研究領域:心臟纖維化  哈爾濱醫科大學
    5. In vitro and in vivo direct monitoring of miRNA-22 expression in isoproterenol-induced cardiac hypertrophy by bioluminescence imaging[J]. 2014, European journal of nuclear medicine and molecular imaging (IF= 7.704). 吉凱產品:腺病毒  研究領域:心臟肥大  哈爾濱醫科大學第四附屬醫院
    6. Silencing of Pellino1 improves postinfarct cardiac dysfunction and attenuates left ventricular remodeling in mice[J]. 2014, Cardiovascular research (IF= 6.290). 吉凱產品:腺病毒  研究領域:心肌梗死  南京醫科大學
    7. α-Enolase plays a catalytically independent role in doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis and mitochondrial dysfunction[J]. 2015, Journal of molecular and cellular cardiology (IF= 5.296). 吉凱產品:腺病毒  研究領域:心肌細胞凋亡和線粒體功能障礙  中山大學

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