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    基因操作工具制備

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    您對肝臟有什么問題嗎?

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    肝臟

    通過使用工具病毒載體介導將外源基因導入靶細胞中,對疾病特定基因進行定向和組織特異性的改造,將為肝臟領域的疾病研究與治療提供強大工具,如肝硬化、肝纖維化等。

    工具病毒選擇指南

    首先,肝臟研究如何選擇合適的病毒載體

    慢病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)等都是常用的工具病毒載體,在肝臟研究中如何選擇合適的病毒工具呢?

    1. 慢病毒:慢病毒具有毒性低、損傷小的特點,且病毒感染細胞后,可以整合入基因組長期表達,是細胞實驗的首選。應用于在體注射時,引起的免疫反應較為溫和。

    2.  腺病毒:腺病毒載體容量大,不整合到染色體中,無插入致突變性。但表達時間短,在大部分細胞中,腺病毒可維持7-14 天的表達時間。且免疫原性高,應用于在體注射時易造成炎癥反應。

    3.  腺相關病毒AAV:AAV 體積小,滴度高,擴散性好,是在體實驗的首選。AAV有多種血清型,不同的血清型對不同的臟器有較高的識別及感染能力,其中AAV2型、8型、9型等對肝臟有較好的趨向性。




    了解了這些病毒載體在肝臟研究中的優勢和不足后,如何根據實驗目的來挑選合適的基因操作工具呢?建議您可以從以下這幾個方面出發:

    1. 工具載體的表達時間與實驗觀察時間是否相符;

    2. 工具載體可以容納的片段大小與目的基因大小是否契合;

    3. 工具載體對目的細胞、在體組織的轉導是否足夠高效。

    病毒表達系統 慢病毒 腺病毒 腺相關病毒
    外源基因表達時間 2-4天開始表達長時間穩定表達 1-2天開始表達持續7-14天 7-14開始表達
    細胞分裂不旺盛部位可長時間表達
    插入片段大小 <4kb <5-8kb <2.8kb (包括必須的啟動子
    以及熒光或者標簽元件)
    穩定細胞株篩選 可以,外源基因整合于
    宿主基因組,篩選簡單
    不可以,瞬時表達外
    源基因傳代后效果減弱
    不可以
    細胞實驗 首選,廣譜,感染效率高 廣譜,感染效率高,
    適合原代非增殖細胞感染
    不適合細胞實驗
    動物實驗 適合,根據觀察時間和注射部位選擇 較適合(免疫原性高),根
    據觀察時間和注射部位選擇
    首選,根據觀察時間和注射部位選擇
    滴度 最高可達109TU/ml 高達1012pfu/ml 高達1012-13v.g/ml

    常用基因操作工具選擇指南




    吉凱小建議:

    1.  在基因大小允許的前提下,在體實驗建議優先選擇腺相關病毒(AAV)。AAV具有滴度高,擴散效果好,免疫原性低等特點,且AAV有多種血清型,2型、8型、9型等對肝臟有較好的趨向性。點擊了解更多AAV血清型選擇小竅門>>



    1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
    心臟






    肝臟












    胰腺






    骨骼肌




    神經

    眼部




    AAV 血清型的趨向性


    2.  細胞體外感染建議選擇慢病毒:慢病毒在感染細胞后2-4 天開始表達,且對細胞毒性低、損傷小。

    3.  如需目的基因在肝臟中特異性表達,可使用組織特異性啟動子,如肝臟特異性啟動子TBG。吉凱提供組織特異性啟動子載體的病毒包裝服務,點擊了解>>

    注射方法

    病毒工具在肝臟中的的注射方法

    肝臟常用的注射方法有尾靜脈和肝門靜脈注射,兩種注射方法用量類似。下面以肝原位注射為例詳細說明。

    1. 腹部切開后,尋找到肝門靜脈:將肝葉提起,下面就是門靜脈,因為下腔靜脈在后方,離腎臟比較近,所以,一般看到的大的靜脈就是門靜脈。

    2. 注射病毒,穿刺后壓迫止血。



    肝門靜脈病毒注射示意圖


    更多工具病毒體內注射實驗操作視頻,點擊查看>>

    用量參考

    肝臟注射病毒用量參考

    以下表格中注射參數來自吉凱客戶發表文獻。更多肝臟病毒注射參數,點擊查看與下載>>


    1. 慢病毒

    注射部位 注射參數 檢測時間 文獻
    大鼠肝門靜脈注射 500μL
    病毒滴度5x 107 TU/mL
    2.5x 107TU
    14天 Effect of the regulation of retinoid X receptor - α gene expres-sion on ral hepatic fibrosis[J]. Hepatology Research, 2011.
    大鼠肝門靜脈注射 100μL
    3x 108TU
    每4天注射一-次,共3次
    26天 Inhibition of hepatic sellate cell activation and liver fibrosis by fat-specific protein 27[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2012.
    大鼠靜脈注射 500 μL
    病毒滴度5 x 107 TU/ml
    2.5x 107TU.注射時間7s
    14天 Peroxisome proliferator -activated receptor gamma inhibits he-patic fibrosis in rats[J]. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases
    International, 2011.
    小鼠尾靜脈注射 4x 108TU 2-3天 Construction of a lentiviral vector containing shRNA targeting ADAM17 and its role in attenuating endotoxemla in mice[J]. Molecular medicine reports, 2017.
    小鼠尾靜脈注射 5x 107IU
    Hepatitis B virus X protein induces hepatic steatosis by en-hancing the expression of liver fatty acid binding protein[J].
    Jourmal of virology, 2016.


    代表文獻 吉凱客戶文章Jourmal of viology,2016,90(4):1729-1740





    2. 腺病毒

    注射部位 注射參數 檢測時間 文獻
    大鼠尾靜脈注射 5 x 109PFU/大鼠
    Paired related homeobox protein 1 regulates PDGF-induced chemotaxis of hepatic sellate cells in liver fibrosis[J]. Laborato-ry Investigation, 2017.
    大鼠尾靜脈注射 100μl,生理鹽水稀釋
    總量1 x 1010病毒顆粒
    1天、2天 Recombinant adenovirus containing hyper-interleukin-6 and hepatocyte growth factor ameliorates acute-on-chronic liver failure in rats[J]. World journal of gastroenterology, 2016.
    小鼠尾靜脈注射

    Decreased MiR- 155 level in the peripheral blood of non-alco-holic fatty liver disease patients may serve as a biomarker and may influence LXR activity[J]. Cellular Physiology and Bio-chemistry, 2016.
    小鼠尾靜脈注射 5 x 108PFU
    一周一次,共2次
    17天 Hepatic SATB1 induces paracrine activation of hepatic stellate cells and is upregulated by HBx[J] .Sci Rep, 2016.
    小鼠尾靜脈注射 100 μl.總量
    2.5x108PFU
    14天 Adenovirus-mediated over-expression of Septin4 ameliorates hepatic fibrosis in mouse livers infected with Schistosoma japonicum[J]. Parasitol. Int, 2015.


    代表文獻(36)吉凱客戶文章Laboratory Investigation,2017,97(9):1020





    3. 腺相關病毒

    注射部位 血清型 注射參數 檢測時間 文獻
    大鼠肝動脈或
    門靜脈原位注射

    2x 1011病毒顆?;?br /> 感染2x 1011AAV
    顆粒的骨髓間充質干細胞
    7, 14,21,28天 Mesenchymal Stem Cells with EnhancedBcl-2 Ex-pression Promote Liver Recovery in a Rat Model of Hepatic Cirrhosis[J]. Cellular Physiology and Bio-chemistry.
    小鼠尾靜脈 AAV9 1 x 1011viral
    particles/mouse
    2周 The histone demethylase KDM4D promotes hepatic fibrogenesis by modulating Toll-like receptor 4 sig-naling pathway[J]. EBioMedicine
    小鼠尾靜脈 AAV9 1 x 1011病毒顆粒/小鼠 2周 The Histone Demethylase KDM4D Promotes He-patic Fibrogenesis by Modulating Toll-Like Receptor 4 Signaling Pathway[J]. bioRxiv
    小鼠尾靜脈
    2x 109PFU
    CARF activates beta-catenin/TCF signaling in the hepatoellular carcinoma[J] Oncotarget


    代表文獻 吉凱客戶文章Cellular physiology and biochemistry,2016,40(5):1117



    引用文獻

    1.The histone demethylase KDM4D promotes hepatic fibrogenesis by modulating Toll-like receptor 4 signaling pathway. 2018, EBioMedicine (IF= 6.183). 吉凱產品:AAV 血清型:AAV9 研究領域:肝纖維化  復旦大學附屬華東醫院
    2. Mesenchymal Stem Cells with Enhanced Bcl-2 Expression Promote Liver Recovery in a Rat Model of Hepatic Cirrhosis. 2016, Cellular Physiology and Biochemistry (IF=5.5). 吉凱產品:AAV 研究領域:肝硬化  哈爾濱醫科大學附屬第二醫院
    3. Hepatitis B virus X protein induces hepatic steatosis by enhancing the expression of liver fatty acid binding protein[J]. 2016, Journal of virology (IF= 4.368). 吉凱產品:慢病毒 研究領域:肝臟脂肪變性  福建醫科大學
    4. Decreased MiR-155 level in the peripheral blood of non-alcoholic fatty liver disease patients may serve as a biomarker and may influence LXR activity[J]. 2016, Cellular Physiology and Biochemistry (IF= 5.5). 吉凱產品:microRNA腺病毒 研究領域:非酒精性脂肪性肝  南京中醫藥大學第二臨床醫學院

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