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    基因操作工具制備

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    眼睛個體小、相對封閉、具備免疫赦免,是基因治療中非常熱門的器官。隨著視網膜和視皮層遺傳性疾病分子機制研究的不斷深入,使用基因治療某些遺傳性眼部疾?。ㄈ缫暰W膜色素變性、缺血性視網膜疾病等)已成為可能。目前使用較多的是通過病毒載體介導將治療基因導入視網膜色素上皮層、視皮層神經元和光感受器等區域,在常見的病毒載體中,腺相關病毒AAV使用較廣泛。

    工具病毒選擇指南

    眼部研究如何挑選合適的工具病毒

    慢病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)等都是常用的工具病毒載體,在眼部的研究中該如何選擇呢?


    1.  慢病毒:慢病毒的優點是可以將靶基因整合入宿主的基因組中持續穩定的表達,引起的免疫反應較為溫和且安全性高。
    2.  腺病毒:腺病毒的載體容量大于慢病毒和AAV,適合大片段基因的病毒包裝。但腺病毒的免疫原性較大,容易引起動物死亡,且在體表達時間短,不適合需要長期觀察的研究。
    3.  腺相關病毒AAV:AAV具有體積小、滴度高的優勢,病毒顆??蓴U散并感染深層組織,同時其還具有免疫原性低、表達時間長的特點,尤其適合眼部注射的動物實驗。影響AAV載體在眼部基因轉移的因素包括AAV載體的血清型、基因轉移途徑、組織特異性啟動子等。AAV有多種血清型,其中2型、5型、8型、9型等對眼部的趨向性較高。




    了解了這些病毒載體在眼部應用中的優勢和不足后,需要根據具體的實驗需求和基因情況選擇合適的病毒載體,吉凱建議您可以從以下這幾個方面出發:

    1. 工具載體的表達時間與實驗觀察時間是否相符;

    2. 工具載體可以容納的片段大小與目的基因大小是否契合;

    3. 工具載體對目的細胞、在體組織的轉導是否足夠高效。


    吉凱基因總結了常用基因操作工具的選擇方法,您可以根據具體實驗需求選擇合適的病毒載體:

    病毒表達系統 慢病毒 腺病毒 腺相關病毒
    外源基因表達時間 2-4天開始表達
    長時間穩定表達
    1-2天開始表達
    持續7-14天
    7-14開始表達
    細胞分裂不旺盛部位可長時間表達
    插入片段大小 < 4kb < 5-8kb <2.8kb (包括必須的啟動
    子以及熒光或者標簽元件)
    穩定細胞株篩選 可以,外源基因整合于
    主基因組,篩選簡單
    不可以,瞬時表達外源
    基因傳代后效果減弱
    不可以
    細胞實驗 首選,廣譜,感染效率高 廣譜,感染效率高,
    適合原代非增殖細胞感染
    不適合細胞實驗
    動物實驗 適合,根據觀察時間
    和注射部位選擇
    較適合(免疫原性高),
    根據觀察時間和注射部位選擇
    首選,根據觀察時間和注射部位選擇
    滴度 最高可達109TU/ml 高達1012pfu/ml 高達1012-13v.g/ml

    常用基因操作工具選擇指南




    吉凱小建議:

    1.  在基因大小允許的前提下,建議您優先選擇AAV。AAV體積小,滴度高,尤其適合眼部病毒注射。且AAV有多種血清型,其中2型、5型、8型、9型等對眼部的趨向性較高。點擊了解更多AAV血清型選擇小竅門>>


    1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
    心臟






    肝臟












    胰腺






    骨骼肌




    神經

    眼部




    AAV 血清型的趨向性


    2.  可使用組織特異性啟動子提升靶基因的特異性表達,如視網膜特異性啟動子rpe65。吉凱基因提供組織特異性啟動子載體的病毒包裝服務,點擊了解>>

    注射方法

    工具病毒眼部注射方法

    病毒載體介導的眼部基因轉移途徑依治療目的不同主要有玻璃體腔注射、視網膜下注射、前房注射、結膜下注射等。下面以角膜下注射為例做詳細說明:

    1、實驗開始前,先將小鼠進行麻醉。
    2、然后將小鼠固定在臺上,并將眼球部分突出。
    3、夾緊小鼠頭部,并對其角鞏膜緣處進行扎孔。扎孔時,一般選擇角膜緣后1mm 位置,注意避開血管。
    4、判斷是否扎孔成功。
    5、扎孔成功后,開始注射病毒。
    6、注射時,針尖垂直進入,隨后傾斜,緩慢推注。



    角膜下病毒注射
    (參考文獻:Journal of Neuroscience Methods, 2008, 167 (2) :191)


    更多部位病毒體內注射操作視頻,點擊查看>>

    用量參考

    眼部注射病毒用量參考

    以下表格中為吉凱客戶應用文獻總結(部分)。更多眼部注射病毒注射參數,點擊查看與下載>>


    1.  腺相關病毒AAV

    注射部位

    AAV類型

    血清型

    注射參數

    檢測時間/天

    文獻名

    大鼠單側視網膜

    AAV-GFP

    AAV2、AAV1

    2ul。2×109vg

    1, 3, 5, 7, 14, 28,
    60, 120, 180,
    240, and 360

    Distinctive Gene Transduction Efficiencies of
    Commonly Used Viral Vectors in the Retina[J].
    Current Eye Research

    小鼠視網膜

    過表達AAV

    AAV2/8

    滴度3.5×1012genome copies/mL。
    1ul/位點。
    左側注射過表達AAV,
    右側PBS

    30天

    Human melanopsin-AAV2/8 transfection to retina transiently restores visual function in rd1 mice [J].
    International Journal of Ophthalmology


    代表文獻 Science,2010,329(5990):413.





    2.  慢病毒

    注射部位 注射參數 檢測時間/天 文獻
    大鼠視網膜 2 μL
    注射總量1E+6 TU
    使用33號針頭
    第3, 14, 180, 240 Distinctive gene transduction efficiencies of commonly used viral vectors in the retina[J]. Current eye research, 2008.
    大鼠玻璃體 10 μ L/eye
    病毒滴度1E+9 TU/ml
    總量1E+7 TU

    MicroRNA-21 could promote the apoptosis of retinal neurons by down-regulating PDCD4 in a rat model of diabetes mellitus[J]. Int J Clin Exp Med, 2017.
    大鼠玻璃體 5 μL
    病毒滴度9E+8 TU/ml
    總量4.5E+6 TU
    使用30號針頭
    每7天檢測一次 Apelin is essential for the development of laser-induced choroidal neovascularization model[J]. Int 」Clin ExpPathol, 2017.
    大鼠玻璃體 5 μL
    病毒滴度2E+9 TU/mi
    總量1E+7 TU
    每7天檢測一次 Inhibition of choroidal neovascularization by lentivi-rus-mediated PEDF gene transfer in rats[J]. International journal of ophthalmology, 2016.
    小鼠玻璃體 2 uL
    病毒滴度2E +9 IU/ml
    總量4E+6 IU

    Lentivirus vector-mediated knockdown of erythropoie-tin-producing hepatoellular carcinoma receptors B4 inhibits laser -induced choroidal neovascularization[J]. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 2013.
    小鼠玻璃體 1.5 uL
    病毒滴度3E+8 TU/ml
    總量4.5E+5 TU
    使用33號針頭

    Ephrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization by Regulating the VEGF Signaling PathwayEphrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization[J]. Investigative ophthalmology & visual science, 2012.




    3.  腺病毒

    注射部位 注射參數 檢測時間 文獻
    大鼠視網膜 2 μl??偭?
    過表達2.16E+10 genome copies.
    對照4.4E+10 genome copies
    每兩周 Overexpression of melanopsin in the retina restores visual function in Royal College of Sur-geons rats[J]. Molecular medicine reports, 2016.
    大鼠視網膜 2 μl
    總量1E+6 pfu
    使用33號針頭
    1,3, 5, 7, 14,
    28, 60, 120,
    180,240,360
    Distinctive gene transduction fficiencies of com-monly used viral vectors in the retina[J]. Current eye research, 2008.
    小鼠玻璃體 1 μl
    Adenoviral Vector-Mediated Delivery of p21WAF1/CIP1 Prevents Retinal Neovascular-ization in an Oxygen-Induced Retinopathy Model [J. Current eye research, 2016.
    小鼠玻璃體 1 μl??偭?E+9 PFU 5天 Inhibition of Oxygen-Induced Ilschemic Retinal Neovascularization with Adenoviral 15-Lipoxy-genase-1 Gene Transfer via Up-Regulation of PPAR-Y and Down-Regulation of VEGFR-2 Expression[J. PloS one, 2014.
    小鼠玻璃體 1 μl??偭?E+9 PFU 5天 Silencing of S100A4, a metastasis associated protein, inhibits retinal neovascularization via the downregulation of BDNF in oxygen-induced isch-aemic retinopathy[J]. Eye, 2016.
    小鼠玻璃體 1 μl??偭?E+9 PFU 6天 Overexpression of 15-ipoxygenase-1 in oxy-gen-induced ischemic retinopathy inhibits retinal neovascularization via downregulation of vascular endothelial growth factor-A expression[J]. Mo-lecular vision, 2012.

    引用文獻

    1. Distinctive Gene Transduction Efficiencies of Commonly Used Viral Vectors in the Retina[J]. Current Eye Research (IF= 2.12). 吉凱產品:AAV-GFP  血清型:AAV2、AAV1  研究領域:視網膜病毒載體轉染效率  上海交通大學附屬第一人民醫院

    2. Human melanopsin-AAV2/8 transfection to retina transiently restores visual function in rd1 mice [J]. International Journal of Ophthalmology (IF= 1.166). 吉凱產品:過表達AAV     血清型:AAV2/8  研究領域:AAV2/8對視網膜轉染效率研究  第三軍醫大學西南眼科醫院

    3. Deacetylation of MnSOD by PARP-regulated SIRT3 protects retinal capillary endothelial cells from hyperglycemia-induced damage[J]. 2016, Biochemical and biophysical research communications (IF= 2.559). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:MnSOD去乙?;瘜σ暰W膜毛細血管內皮細胞的保護機制研究  上海交通大學附屬第一人民醫院

    4. Ephrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization by Regulating the VEGF Signaling PathwayEphrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization[J]. 2012, Investigative ophthalmology & visual science (IF= 3.388). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:視網膜血管新生  北京大學人民醫院

    5. Inhibition of Oxygen-Induced Ischemic Retinal Neovascularization with Adenoviral 15-Lipoxygenase-1 Gene Transfer via Up-Regulation of PPAR-γ and Down-Regulation of VEGFR-2 Expression[J]. 2014, PloS one (IF=2.766 ). 吉凱產品:腺病毒  研究領域:視網膜血管新生  武漢大學人民醫院

    6. Silencing of S100A4, a metastasis-associated protein, inhibits retinal neovascularization via the downregulation of BDNF in oxygen-induced ischaemic retinopathy[J]. 2016, Eye (IF= 2.478). 吉凱產品:腺病毒  研究領域:視網膜血管新生  武漢大學人民醫院

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