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    基因操作工具制備

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    通過使用工具病毒載體介導將外源基因導入肺部細胞中,對疾病特定基因進行定向和組織特異性的改造,將為肺疾病研究與治療提供強大工具。

    工具病毒選擇指南

    首先,如何選擇合適的病毒載體:

    慢病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)等都是常用的工具病毒載體,在肺部研究中該如何選擇呢?

    1.  慢病毒:慢病毒具有毒性低、損傷小的特點,且病毒感染細胞后,可以整合入基因組長期表達,是細胞實驗的首選。應用于肺部在體注射時,引起的免疫反應較為溫和。

    2.  腺病毒:腺病毒滴度高,載體容量大。但應用于在體注射時易引起較強烈的免疫反應,嚴重時可導致實驗動物死亡。

    3.  腺相關病毒AAV:AAV 體積小,滴度高,擴散性好,是在體實驗的首選。AAV有多種血清型,不同的血清型對不同的臟器有較高的識別及感染能力。AAV5、AAV6和AAV9等對于肺有較高的趨向性。目前,AAV已經應用于肺囊性纖維化的臨床實驗中。




    了解了這些病毒載體在肺部研究中的優勢和不足后,如何根據實驗目的來挑選合適的基因操作工具呢?建議您可以從以下這幾個方面出發:


    1.  工具載體的表達時間與實驗觀察時間是否相符;

    2.  工具載體可以容納的片段大小與目的基因大小是否契合;

    3.  工具載體對目的細胞、在體組織的轉導是否足夠高效。

    病毒表達系統 慢病毒 腺病毒 腺相關病毒
    外源基因表達時間 2-4天開始表達
    長時間穩定表達
    1-2天開始表達
    持續7-14天
    7-14開始表達
    細胞分裂不旺盛部位可長時間表達
    插入片段大小 < 4kb < 5-8kb <2.8kb (包括必須的啟動
    子以及熒光或者標簽元件)
    穩定細胞株篩選 可以,外源基因整合于
    主基因組,篩選簡單
    不可以,瞬時表達外源
    基因傳代后效果減弱
    不可以
    細胞實驗 首選,廣譜,感染效率高 廣譜,感染效率高,
    適合原代非增殖細胞感染
    不適合細胞實驗
    動物實驗 適合,根據觀察時間
    和注射部位選擇
    較適合(免疫原性高),
    根據觀察時間和注射部位選擇
    首選,根據觀察時間和注射部位選擇
    滴度 最高可達109TU/ml 高達1012pfu/ml 高達1012-13v.g/ml

    常用基因操作工具選擇指南




    吉凱小建議:

    1.  在基因大小允許的前提下,在體實驗建議優先選擇腺相關病毒(AAV)。AAV具有滴度高,擴散效果好,免疫原性低等特點。AAV5/6/9血清型對肺有較好的趨向性,其中AAV9在肺部的表達最強,且產生的免疫反應較小。點擊了解更多AAV血清型選擇小竅門>>


    1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
    心臟






    肝臟












    胰腺






    骨骼肌




    神經

    眼部




    AAV 血清型的趨向性

    2.  細胞體外感染建議選擇慢病毒:慢病毒在感染細胞后2-4 天開始表達,且對細胞毒性低、損傷小。

    3.  如需目的基因在肺部中特異性表達,可使用組織特異性啟動子,如肺上皮細胞特異性啟動子SP-C。吉凱提供組織特異性啟動子載體的病毒包裝服務,點擊了解>>

    注射方法

    病毒工具在肺部的注射方法

    肺部病毒感染常用的方法有系統注射(尾靜脈注射或腹腔注射)、及鼻內或氣管內遞送(經呼吸道)等。下面,以鼻內滴注為例做詳細說明。

    1. 使動物處于足夠深的麻醉狀態,以防止小鼠運動或對載體的反應而打噴嚏或咳嗽,但也需要防止小鼠麻醉過度而死亡。

    2. 將小鼠以背臥姿勢固定,并慢慢地將AAV 懸液通過小鼠鼻孔內壁逐滴滴入,為保證最大的肺部感染效率,最小體積為50μL(每個鼻孔25μL),最大體積為75μL(每個鼻孔37.5μL)。待小鼠呼吸恢復正常后,再滴入一次75μL 的AAV 懸液。

    3. 將小鼠輕輕從工作臺拿下,并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高,以保證小鼠順暢的呼吸。待小鼠蘇醒后,放回鼠籠。


    備注:鼻內滴注法是一種直接的AAV 感染法,操作簡單且對設備要求低。但AAV 顆粒容易沉積在上呼吸道(鼻道、鼻竇和咽)和胃腸道,如需要有效地感染到下呼吸道,則需要加大AAV劑量。


    更多部位病毒體內注射實驗操作視頻,點擊查看>>

    用量參考

    肺部注射病毒用量參考

    以下表格中為吉凱客戶應用文獻總結(部分)。更多肺部病毒注射參數,點擊查看與下載>>


    1. 慢病毒

    注射方式 注射參數 檢測時間 文獻
    小鼠靜脈 病毒滴度5x 107TU/ml
    5天、30天 Inhibiting toll like receptor 4 signaling ameliorates pulmonary-fibrosis during acute lung injury induced by lipopolysaccha-ride:an experimental study[J]. Respiratory research, 2009.
    大鼠側尾靜脈 1x108TU
    每2周注射一次
    共注射1個月

    KLF5 mediates vascular remodeling via HIF-1x in hypoxic pulmonary hypertension[J. American Journal of Physiolo-gy-Lung Cellular and Molecular Physiology, 2016.
    小鼠腹腔注射 2x106TU
    分別在1,3,7, 10, 14,
    21, 28 and 35天注射
    40天后
    處死小鼠
    miR- 18a-5p Inhibits Sub-pleural Pulmonary Fibrosis by Tar-geting TGF- β Receptor I.J] .Mol. Ther, 2017
    大鼠腹腔注射 3E+8 TU/kg rat 14天 Placenta growth factor contributes to cell apoptosis and epithe-lial-to-mesenchymal transiltion in the hyperoxia -induced acutelung injury[J]. Life sciences, 2016
    小鼠鼻內滴注 50μL,4x107PFUs
    Silencing Angiopoietin- Like Protein 4 (ANGPTL4) Protects Against Lipopolysaccharide. Induced Acute Lung Injury Via Regulating SIRT1/NF - kB Pathway[J]. Journal of cellular physiology, 2015


    代表文獻 Cell death & disease,2017,8(1):e2566




    2. 腺病毒

    注射方式 注射參數 檢測時間 文獻
    大鼠尾靜脈注射 病毒滴度1E+8 pfu/ml 3天 Adenovirus-delivered angiopoietin-1 treatment for phos-gene-induced acute lung injury[J]. Inhalation toxicology, 2013
    小鼠鼻內滴注 5E +8 pfu/mouse 4天 Uncoupling protein 2 increases susceptibility to lipopolysac-charide-induced acute lung injury in mice[J]. Mediators of inflammation, 2016.


    代表文獻 Europenan Respiratory Journal,2010,36(4):907-914




    3. 腺相關病毒AAV

    代表文獻 Human Gene Therapy,2007,18(4):344-354


    引用文獻

    1. miR-18a-5p Inhibits Sub-pleural Pulmonary Fibrosis by Targeting TGF-β Receptor II[J]. 2016,Molecular Therapy (IF= 7.008). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:肺纖維化  華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院

    2. Uncoupling protein 2 increases susceptibility to lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J]. 2016, Mediators of inflammation (IF= 3.549). 吉凱產品:腺病毒  研究領域:急性肺損傷  陸軍軍醫大學新橋醫院

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