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    基因操作工具制備

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    其它(脂肪、骨、腎臟)

    通過使用工具病毒載體介導將外源基因導入靶細胞中,對疾病特定基因進行定向和組織特異性的改造,將為疾病研究與治療提供強大工具。

    工具病毒選擇指南

    首先,如何選擇合適的病毒載體:

    病毒、腺病毒和腺相關病毒(AAV)等都是常用的工具病毒載體,在不同疾病研究中該如何選擇呢?


    1.  慢病毒:慢病毒具有毒性低、損傷小的特點,且病毒感染細胞后,可以整合入基因組長期表達,是細胞實驗的首選。應用于在體注射時,引起的免疫反應較為溫和。

    2.  腺病毒:腺病毒載體容量大,不整合到染色體中,無插入致突變性。但表達時間短,在大部分細胞中,腺病毒可維持7-14 天的表達時間。且免疫原性高,應用于在體注射時易造成炎癥反應導致實驗動物死亡。

    3.  腺相關病毒AAV:AAV 體積小,滴度高,擴散性好,是在體實驗的首選。AAV有多種血清型,不同的血清型對不同的臟器有較高的識別及感染能力。




    了解了這些病毒載體的優勢和不足后,如何根據實驗目的來挑選合適的基因操作工具呢?建議您可以從以下這幾個方面出發:

    1.  工具載體的表達時間與實驗觀察時間是否相符;
    2.  工具載體可以容納的片段大小與目的基因大小是否契合;
    3.  工具載體對目的細胞、在體組織的轉導是否足夠高效。

    病毒表達系統 慢病毒 腺病毒 腺相關病毒
    外源基因表達時間 2-4天開始表達
    長時間穩定表達
    1-2天開始表達
    持續7-14天
    7-14開始表達
    細胞分裂不旺盛部位可長時間表達
    插入片段大小 < 4kb < 5-8kb <2.8kb (包括必須的啟動
    子以及熒光或者標簽元件)
    穩定細胞株篩選 可以,外源基因整合于
    主基因組,篩選簡單
    不可以,瞬時表達外源
    基因傳代后效果減弱
    不可以
    細胞實驗 首選,廣譜,感染效率高 廣譜,感染效率高,
    適合原代非增殖細胞感染
    不適合細胞實驗
    動物實驗 適合,根據觀察時間
    和注射部位選擇
    較適合(免疫原性高),
    根據觀察時間和注射部位選擇
    首選,根據觀察時間和注射部位選擇
    滴度 最高可達109TU/ml 高達1012pfu/ml 高達1012-13v.g/ml

    常用基因操作工具指南




    吉凱小建議:

    1.  在基因大小允許的前提下,在體實驗建議優先選擇腺相關病毒(AAV)。AAV具有滴度高,擴散效果好,免疫原性低等特點,且AAV有多種血清型,如9型、DJ型等對脂肪有較好的趨向性。點擊了解更多AAV血清型選擇小竅門>>


    1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
    心臟






    肝臟












    胰腺






    骨骼肌




    神經

    眼部




    AAV 血清型的趨向性


    2.  細胞體外感染建議選擇慢病毒:慢病毒在感染細胞后2-4 天開始表達,且對細胞毒性低、損傷小。

    3.  如需目的基因在某組織中特異性表達,可使用組織特異性啟動子,如脂肪細胞特異性啟動子FABP4、成骨細胞早期特異性啟動子mRUNX2、軟骨細胞特異性啟動子COL2A1等。吉凱提供組織特異性啟動子載體的病毒包裝服務,點擊了解>>

    用量參考

    脂肪、骨、腎臟等研究領域病毒用量參考

    以下表格中為吉凱客戶應用文獻總結(部分)。更多部位病毒注射參數,點擊查看與下載>>


    1.  脂肪

    病毒 物種 注射部位 注射參數 檢測時間 文獻
    慢病毒 小鼠 尾靜脈注射 100 μl 總量6x 107TU/ mouse 12天 Glucocorticoids;transcriptionally;regulate miR- 27b expression promoting body fat accumu-lation via suppressing the browning of white adi-pose tissue[J]. Diabetes, 2014
    小鼠 尾靜脈注射 總量1x106IU/ mouse
    The stem cell factor/Kit signalling pathway regu-lates mitochondrial function and energy expendi-ture[J]. Nature communications, 2014
    AAV 小鼠 雙側附睪
    脂肪層注射
    滴度5E 12vg/ml.
    小鼠雙側脂肪層共
    注射10ul,多點注射
    2周 Switching harmful visceral fat to beneficial energy combustion improves metabolic dysfunctions. JCI Insight




    2.  腎

    病毒 物種 注射部位 注射參數 檢測時間 文獻
    慢病毒 大鼠 左腎
    多位點注射
    5x107TU 10天 Biological effects of lentivirus -mediated shRNA targeting collagen type I on the mesangial cells of rats[J. Renal failure, 2011.
    大鼠 尾靜脈注射 1ml.注射
    總量1x 108TU
    31/7/14/28天 Does crystal deposition in genetic hypercalciuricrat kidney tissue share similarities with bone for-mation[J]. Urology, 2014.




    3.  關節

    病毒 物種 注射方式 注射參數 文獻
    AAV 小鼠 關節內注射 使用33號針頭 Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degen-eration during the pathogenesis of osteoarthritis. Nature Commu-nications, 2019
    慢病毒 小鼠 關節內注射 10μ L/joint.注射時間:
    10, 25, and 40 days
    after OA induction,使用
    胰島素注射針頭
    Down- Regulation of Rac GTPase - Activating Protein OCRL1 Causes Aberrant Activation of Rac1 in Osteoarthritis Development [J]. Arthritis & Rheumatology, 2015
    大鼠 骨關節內注射 20 μl,病毒滴度1E+8
    TU/ml。注射總量2E+6
    TU
    Protective effect of lentivirus -mediated siRNA targeting ADAMTS-5 on cartilage degradation in a rat model of osteoarthri-tis[J]. International journal of molecular medicine, 2013
    腺病毒 大鼠 關節內注射 每3天一次. 50 μ/knee
    knee,滴度1E+9
    pfu/ml,總量5E+7
    pfu/knee.第一次注射后
    7天和14天檢測
    Silencing of miR-101 Prevents Cartilage Degradation by Regulat-ing Extracellular Matrix一related Genes in a Rat Model of Osteoar-thritis[J]. Molecular Therapy, 2015

    引用文獻

    1. The stem cell factor/Kit signalling pathway regulates mitochondrial function and energy expenditure[J]. 2014, Nature communications (IF= 12.353). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:線粒體功能和能量消耗機制研究  南京大學

    2. Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis. 2019, Nature communications(IF= 12.353). 吉凱產品:干擾AAV  研究領域:骨關節炎  中國人民解放軍總醫院

    3. Glucocorticoids transcriptionally regulate miR-27b expression promoting body fat accumulation via suppressing the browning of white adipose tissue[J]. 2014,Diabetes(IF=7.273). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:脂肪褐變  南京醫科大學附屬第一醫院
    4. Switching harmful visceral fat to beneficial energy combustion improves metabolic dysfunctions. JCI Insight. 吉凱產品:干擾AAV  研究領域:脂肪代謝  山東大學齊魯醫院

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