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    基因操作工具制備

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    鈣離子成像

    鈣離子成像技術是通過鈣離子熒光探針將外源性熒光信號和生理現象耦合起來,通過熒光染料信號的改變反映細胞內游離鈣離子濃度,以表征細胞狀態的一種技術。


    為什么要檢測鈣離子信號?

    鈣離子是哺乳動物神經元中必需的細胞內信使,在靜息狀態下,大多數神經元的胞內鈣離子濃度大約為50~100nM,其在電活動期間可瞬時升高10~100倍。鈣離子作為細胞內的信號可觸發響應,例如改變基因的表達和突觸囊泡中神經遞質的釋放。由于細胞內有離子泵在各種信號刺激下選擇性地運輸這些離子,胞內鈣濃度是高度動態的。鈣成像技術利用鈣離子流的優勢和特殊的熒光染料或者蛋白質熒光探針(鈣離子指示劑,calcium indicator),在活神經細胞上直接可視化鈣信號,從而達到監測神經元活動的目的,已被廣泛應用于神經系統方面的研究。

    基本原理

    目前,使用較多的鈣離子指示劑主要包括化學熒光指示劑和熒光蛋白指示劑兩大類。熒光蛋白鈣指示劑,又稱為遺傳編碼鈣指示劑(genetically encoded calcium indicators,GECIs),可分為兩種類型,對于FRET-based GECI,當環境中不存在鈣離子時,在440nm的激發波長下,ECFP產生藍色熒光,Venus不產生熒光;而當存在鈣離子時,鈣離子與鈣調蛋白CaM結合,在440nm激發波長下ECFP發生能量共振轉移至Venus,最終產生黃色熒光;對于Single-fluorophore GECI,在鈣的存在下,鈣調蛋白-M13相互作用引起熒光團環境中的構象變化,導致熒光發射增加。


    目前常用的熒光蛋白指示劑有Cameleons、TN-XXL、GCaMP、Pericams和Camgaroo等。GCaMP系列蛋白(Single-fluorophore)特別是GCaMP6系列蛋白是最主要的鈣離子指示劑,且越來越多地被用于體內鈣成像研究。GCaMP6比GCaMP3強10倍,動力學快2倍。其中GCaMP6s (slow),6m (medium),6f (fast)分別代表慢,中,快三種動力學性質(動力學越快越適合檢測快速變化的鈣信號)。GCaMP6s熒光變量最大,GCaMP6f最靈敏。

    基于FRETGECIA)和單熒光蛋白GECIB)作用原理示意圖


    應用方向

    鈣成像技術主要應用于神經系統研究,以研究在錯綜復雜的神經系統中鈣離子的變化。包括以下幾方面:


    1. 體外研究突觸前和突觸后的功能結合鈣離子成像和雙光子顯微鏡技術,研究者發現鈣離子信號受限于樹突棘(神經元之間興奮傳遞的突觸后位點)

    2. 體內研究神經元的樹突和樹突棘的活動通過鈣離子成像記錄單根樹突以及樹突棘的鈣離子信號可以精準地知道是神經元上的哪些部位參與了神經元反應

    3. 體內研究不同動物模型的神經元電路目前利用鈣成像技術在嚙齒類、果蠅、線蟲、斑馬魚甚至靈長類動物中都能進行單個細胞的動作電位記錄

    4. 研究行為動物的神經元活動鈣成像技術的發展使得實時記錄休息或者運動狀態下的動物的神經元反應都成為可能


    鈣離子成像常用病毒工具

    鈣離子成像常用的病毒工具——AAV鈣指示劑


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    貨號 載體名稱 啟動子 啟動子表達位置 主要元件 熒光 表達方式
    AAV00041 pAAV-CAG-Flex-GCaMP6(S) Cag 谷氨酸能神經元 Flex-GCaMP6(S) Cre誘導表達
    AAV00068 pAAV-CaMKlla-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato CaMKlla 谷氨酸能神經元 GCaMP6(F) dTomato 正常表達
    AAV00073 pAAV-CaMKlla-GCaMP6f CaMKlla 谷氨酸能神經元 GCaMP6(F) 正常表達
    AAV00074 pAAV-CaMKlla-GCaMP6s CaMklla 谷氨酸能神經元 GCaMP6(S) 正常表達
    AAV00075 pAAV-CaMilla-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato CaMKlla 廣譜 GCaMP6(S) dTomato 正常表達
    AAV00044 AAV-CMV-GCaMP6(F) CMV 廣譜 GCaMP6(F) 正常表達
    AAV00045 pAAV-CMV bGlobin-GCaMP6(S)- 3Flag CMV-bGlobin 廣譜 GCaMP6(S) 3Flag 正常表達
    AAV00092 pAAV- EF1a-DI0-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato EF1a 廣譜 DIO-GCaMP6f dTomato Cre誘導表達
    AAV00094 pAAV-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato EF1a 神經元 DIO-GCaMP6f dTomato Cre誘導表達
    AAV00054 pAAV-hSyn-GCaMP6(F) hSyn 神經元 GCaMP6(F) 正常表達
    AAV00058 pAAV-hSyn1-mRuby2-GSG-P2A-GCaMP6F-WPRE -PA hSyn 神經元 GCaMP6(F) mRuby2 正常表達
    AAV00063 pAAV-hSyn-Flex- GCaMP6f hSyn 神經元 GCaMP6(F) 正常表達
    AAV00067 pAAV-hSyn1-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato hSyn 神經元 GCaMP6(F) dTomato 正常表達
    AAV00032 pAAV-hSyn1-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato hSyn 神經元 GCaMP6(S) nls-dTomato 正常表達
    AV00053 pAAV-hSyn-GCaMP6s hSyn 神經元 GCaMP6(S) 正常表達
    AAV00059 pAAV-hSyn1-mRuby2-GSG-P2A-GCaMP6s-WPRE -pA hSyn 神經元 GCaMP6(S) mRuby2 正常表達
    AAV00064 pAAV-hSyn-Flex-GCaMP6s hSyn 神經元 GCaMP6(S) 正常表達


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    如何使用鈣離子成像病毒工具進行研究

    Step1:選擇合適的鈣離子指示劑

    鈣離子指示劑分為化學熒光指示劑和GECI指示劑,其中GECI指示劑GCaMP6f和GCaMP6s被廣泛應用于活體鈣成像研究。


    Step2:將鈣離子指示劑轉運至目標部位

    化學熒光指示劑通常采用電極刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式進入到目標部位,而GECI指示劑則主要借助于病毒感染的方式導入至目標部位。


    Step3:收集信號,記錄結果

    鈣離子成像技術通常與顯微鏡技術連用來記錄鈣離子的變化。


    鈣成像技術示意圖

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