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    靶標篩選

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    單細胞測序

    單細胞轉錄組測序( Single -cell RNA -sequencing)是指在單細胞水平上對 RNA 進行高通量測序和分析的新技術。 不同于常規組織或細胞群測序得到的結果(只是大量細胞平均表達水平),單測序能夠深入挖掘特異性的信息。 目前 ,單細胞測序已廣泛應用于腫瘤異質性、免疫微環境神經科異質性、免疫微環境神經科 、胚胎發育細胞分化等領域的研究


    單細胞測序的原理和平臺:


    BD Rhapsody(基于microwell的原理)


    (來源于文獻)


    10X genomics (基于DROP-seq的原理)

    (來源于文獻)

    技術優勢

    對于多細胞生物來說,細胞與細胞之間是存在差異的。受精卵從一個細胞開始分裂到最終發育成成熟的個體,各種功能細胞之間的差異會越來越大,表達各自不同的基因,決定不同的生理功能。疾病的發生過程中,伴隨多種細胞的參與,不同細胞也會受到不同影響,如腫瘤的異質性、原發灶、轉移灶、腫瘤微環境細胞等其基因表達有很大的差異,這些差異決定了腫瘤細胞對治療的反應。

    傳統的研究方法由于技術限制,是在多細胞水平進行的,獲得的基因表達信息是細胞群體的平均信號,丟失了細胞個體特異的基因表達信息。為了更加精細地研究基因表達與細胞功能的關系,單細胞水平進行檢測是更加準確的方法,獲得的基因表達信息也更加直觀。單細胞測序的發展將基因表達與細胞功能的研究帶入了一個新的時代。


    單細胞測序解決了單個細胞RNA量少的問題:

    在單細胞測序出現之前,主要是Bulk RNA-seq,即測量一個大的細胞群體中每一個基因的平均表達水平,但對于基因表達的本質研究不夠深入,很多基因表達的時空信息被掩蓋。scRNA-seq直到2014年后才降測序費用降低到可接受的水平,逐漸進入大家的視野。它測定的是細胞種群中每個細胞中的基因的表達量分布,對于研究特定細胞基因表達的變化意義重大。能同時測定的細胞數量從最初的幾十上百個到現在的成千上萬個,向著高通量的方向快速發展。將研究推升到一個更加精準的方向。


    單細胞測序可以解決的科學問題

    1.研究對象中細胞一共分多少群?

    2.每個群對應哪種細胞?

    3.如何定義新的細胞類群?

    4.已知的某類細胞是否可分成幾個亞群?

    5.每個細胞群/亞群的marker基因?

    6.不同樣本(病人)間的細胞構成有何差異?

    7.細胞構成和基因表達差異與表型的關系?

    技術參數

    樣本的要求

    1. 總量> 104目標細胞個數(最少10,000個細胞);

    2. 濃度500-1,000個/uL;

    3. 細胞間無粘連(成團率<5%);

    4. 無大于40um的細胞碎片或其他顆粒物;

    5. 細胞成活率應大于80%(臺盼藍染色檢測);

    6. 不存在逆轉錄抑制劑和非細胞的核酸分子。

    常規項目周期

    45-50個工作日

    分析內容

    單細胞轉錄組 分析內容
    標準分析 1.數據預處理
    1.1基因組比對及基因表達定量
    1.2基因及樣本過濾
    1.3細胞周期效應評估
    2.細胞聚類和可視化
    2.1 louvain算法聚類
    2.2 T-SNE、umap、Force-directed graph drawing可視化
    高級分析 3.細胞類型注釋
    3.1細胞類型注釋及可視化
    3.2 Marker基因heatmap
    3.3 Marker基因小提琴圖
    4. Marker基因分析
    4.1 Logistic Regression算法
    4.2 t-test_overestim算法
    4.3 Wilcoxon算法
    5.多樣本比較分析
    5.1各樣本中的細胞類型分布比例統計
    5.2各樣本和Cluster中細胞數目統計
    5.3各樣本和Cluster中轉錄本表達豐度統計
    5.4各樣本和cluster中基因數目統計



    細胞群體能被分成多種亞群



    不同亞群的細胞表達不同的marker基因


    相同的基因在不同的細胞中呈現差異表達,細胞的功能和命運也因此而不同



    參考文獻

    1.Aizarani, N. et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature 572, 199-204, doi:10.1038/s41586-019-1373-2 (2019).

    2.Birey, F. et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature 545, 54-59, doi:10.1038/nature22330 (2017).

    3.Fan, H. C., Fu, G. K. & Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science 347, 1258367, doi:10.1126/science.1258367 (2015).

    4.Azizi, E. et al. Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. Cell 174, 1293-1308 e1236, doi:10.1016/j.cell.2018.05.060 (2018).

    5.Zheng, C. et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell 169, 1342-1356 e1316, doi:10.1016/j.cell.2017.05.035 (2017).

    6.Young, M. D. et al. Single-cell transcriptomes from human kidneys reveal the cellular identity of renal tumors. Science 361, 594-599, doi:10.1126/science.aat1699 (2018).

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